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Cat. Number
MF985
Chemical Name
聚合美无内毒素质粒大提试剂盒 M5 Easy-High EndoFree Plasmid Maxi Kit
Qty 1
10T/1298元
Qty 2
5x10T/5998元
References


Easy-High EndoFree Plasmid Maxi Kit 

无内毒素质粒大提试剂盒使用说明书


产品简介

聚合美质粒大提试剂盒适用于无内毒素高纯度质粒 DNA 的大量制备与纯化,柱上去除内毒素,操作简单.菌体经改良的碱裂解处理,质粒可从菌体中释放出来,并特异高效地被离心柱硅胶膜吸附.通过去蛋白液和漂洗液的清洗可去除蛋白及其他杂质,最后得到高纯度的无内毒素质粒 DNA,所得质粒可直接用于酶切,转化,PCR,测序,细胞转染等分子生物学实验.高拷贝质粒,100ml 菌液通常能提到500-1500ug 质粒,低拷贝质粒,200ml 菌液通常能提到 200-600ug 质粒(提取效率优于市面上其他品牌同等产品).订购热线:021-60498804

产品特色

  1. 快捷、高效:颜色变化,适合判断;操作简便,得率高,节约时间;

  2. 纯度高:沉淀致密,去杂干净;

  3. 内毒素去除简单:柱上去除内毒素,方便快速,清除干净。

产品组份

试剂盒成分10 T
Buffer BL25 ml
Solution I100 ml
Solution II100 ml
Solution N3100 ml
ToxinOut Buffer60 ml
Buffer WB2 (concentrate)60 ml
Buffer EB30 ml
RNase A (10 mg/ml)1 ml
MaxiSpin Columns with Collection Tubes (50 ml)10 个
Collection Tubes (50 ml)10 个

注意:使用前将全部 RNase A 溶液加到 Solution I 中混合均匀,2-8℃保存;按要求在 Buffer WB2 中加入无水乙醇)

储存条件

15-25℃干燥条件下,可保存 12 个月;更长时间的保存可置于 2-8℃。单独包装的 RNase A 在室温可稳定保存 12 个月。加入 RNase A 后的 Solution I 应置于 2-8℃保存,可稳定保存 6 个月。若溶液 II 产生沉淀,应在使用前置于 37℃下溶解沉淀后再使用。

注意事项

  1. 细菌培养时间一般为 12-16 小时(用锥形瓶或者试管摇菌,留够足够的空间让细菌接触空气,利于细菌生长),如接种量大则 应减少培养时间,过度培养会降低质粒质量甚至导致质粒 DNA 突变;

  2. 每次使用时都要注意 Solution II 和 N3 是否形成沉淀,如有沉淀 37℃溶解后再用;

  3. 加入 Solution II 裂解细菌,直至溶液成紫红色粘稠透明状,时间过长会导致质粒 DNA 打断变性;

  4. 质粒的产量跟细菌量、质粒拷贝数、质粒大小和操作规范程度密切相关。

操作步骤

柱平衡:向吸附柱中(吸附柱放入收集管中)加入 2.5 ml 的平衡液 BL,10,000 rpm 离心 2 min,弃收集管中滤液,将吸附柱重新 放回收集管中。(请使用当天处理过的柱子)

  1. 取 100-200 ml(低拷贝质粒可收集更多菌液,最高 300ml 菌液)过夜培养的菌液,室温 10,000 rpm 离心 2 min,弃上清。

  2.  加入 10 ml Solution I,旋涡震荡或用移液器充分吹打使菌体重悬均匀,呈现出均匀混浊的棕红色。 注意:菌体沉淀一定要悬浮均匀,如有未彻底悬浮的菌块会影响裂解,导致提取的质粒浓度及纯度降低。

  3.  加入 10 ml Solution II,温和颠倒混匀使菌体完全裂解,直到溶液变成清亮、粘稠的紫红色。 注意:不可剧烈震荡,以免造成基因组 DNA 片段的污染,所用时间不要超过 5 min,以免质粒受到破坏,如未完全变得清亮,可能 是菌体太多,可增加 Solution II 的用量,在后续的操作中 Solution N3 的用量也要相应增加。

  4. 加入 10 ml Solution N3,立即温和颠倒混匀,可见红黄相间的絮状物产生,继续混匀直到完全变为黄色。然后 10,000 rpm 离心 10 min,将上清转移至干净离心管(自备)中,注意不要带入沉淀。 注意:1)Solution N3 加入后应立即混合,避免产生局部沉淀,如果上清中还有紫色漂浮物,说明复性不充分,继续混匀至溶液颜 色完全变为澄清的黄色。 2)离心后在最上层可能会形成一层致密的漂浮膜,注意不要倒入吸附柱。 (如果实验室离心机采用吊篮式,不是固定转子,转速达不到 10000rpm,可以采用吊篮离心的最大转速 4250g,离心 10 分钟)

  5. 加入 0.3 倍滤液体积的异丙醇,上下颠倒混匀。 注意:加入异丙醇过多容易导致 RNA 污染。

  6. 将步骤 5 中液体与异丙醇的混合溶液转移到平衡好的吸附柱中(使用当天用平衡液处理的吸附柱,放入 50 ml 收集管中), 10,000 rpm 离心 1 min,弃收集管中的滤液。 注意:吸附柱的最大容积为 15 ml,所以上步中所得溶液分多次过柱。如果离心机转子倾角较大时,建议加入吸附柱的溶液体积不 超过 10 ml,以防发生漏液现象。

  7. 向吸附柱中加入 5 ml ToxinOut Buffer,室温静置 5 min,10,000 rpm 离心 1 min,弃收集管中滤液。

  8.  加入 10 ml Buffer WB2,室温 10,000 rpm 离心 1 min,弃收集管中滤液。 注意:Buffer WB2 为浓缩液,按要求加入无水乙醇,用后应立即盖紧瓶盖,以防酒精挥发。

  9.  加入 5 ml Buffer WB2,室温 10,000 rpm 离心 1 min,弃收集管中滤液。

  10. 室温 10,000 rpm 离心 5 min,甩干残留液体。

  11. 将离心吸附柱置于一个新的 50 ml 塑料离心管中,打开管盖,放置 5 min,使乙醇彻底挥发干净。

  12. 加入 1-2 ml 洗脱液 Buffer EB,室温放置 2 min,10,000 rpm 离心 2 min,离心管底溶液即质粒 DNA。 注意:为增加洗脱效率,可将得到的质粒溶液重新加入到吸附柱中重复步骤 11 一次,如需使用去离子水洗脱,可用 NaOH 调整其 pH 值在 7.0 - 8.5 之间。

低拷贝或大质粒(>10 kb)提取】 

低拷贝质粒,或>10 kb 的质粒,或提取农杆菌质粒,或提取革兰氏阳性菌质粒,应加大菌体使用量,使用 300-500 ml 过夜培养物, 最后洗脱液 Buffer EB 60℃水浴预热,吸附和洗脱时可以适当延长时间,以增加提取效率。其它步骤相同。

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时,本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。

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